Andrea Glas - Strukturbiologische und mechanistische Untersuchungen zur Erkennung und Reparatur von DNA-Photoschäden

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Produktbeschreibung

Es ist bekannt, dass der UV-Anteil des Sonnenlichts zur Schädigung der DNA und zur Ausbildung einer Vielfalt an DNA-Photoschäden führt. Die dabei entstehenden cytotoxischen und mutagenen Schäden sind Cyclobutanpyrimidindimere (CPD-Schäden), (6-4)- Photoschäden, als auch dessen Dewar Valenz-Isomere. Heutzutage besteht kein Zweifel daran, dass diese Schäden eng mit dem Auftreten von Hautkrebs in Verbindung stehen. Um sich vor den negativen Auswirkungen der Photoschäden schützen zu können, haben sich alle dem Sonnenlicht ausgesetzte Lebewesen im Laufe der Evolution ein multifunktionelles und effizientes Reparatursystem angeeignet. Hier wären zum Beispiel die Exzisionsreparatur von geschädigter DNA und die direkte Reversion der Schäden zu nennen. Die letztgenannte Form der Reparatur nennt man Photoreaktivierung und wird der Enzymklasse der Photolyasen zugeschrieben. Diese Photolyasen sind paradoxerweise in der Lage, mit Hilfe von UV-A/Bbzw. Blaulicht (300 – 500 nm), Pyrimidindimere wieder in ihre intakten Basen umzuwandeln. Die Photolyasen sind hochselektive Enzyme und lassen sich je nach Substratspezifität in CPD- und (6-4)-Photolyasen unterteilen. In den letzten Jahren hat sich der CPD-Schaden zusammen mit der CPD-Photolyase als Modellsystem bei der Untersuchung zur Entstehung und Reparatur von DNA-Photoschäden entwickelt. So sind zum Beispiel der Reparaturmechanismus sowie die Cofaktoren- Zusammensetzung der CPD-Photolyasen weitestgehend geklärt. Im Gegensatz dazu weiß man vergleichsweise wenig über die (6-4)-Schäden und ihre Photolyasen. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den CPD-Photolyasen, wurde für die (6-4)-Photolyasen ein ähnlicher Reparaturmechanismus postuliert, wobei jedoch der dabei auftretende viergliedrige Übergangszustand (ein Oxetan- oder Azetidin-Intermediat) experimentell nicht nachgewiesen werden konnte. Um speziell diese als auch weitere Fragen bezüglich der (6-4)-Schadenserkennung und Reparatur durch die (6-4)-Photolyasen klären zu können, musste der (6-4)-Schaden in ausreichenden Mengen für biochemische und strukturbiologische Experimente synthetisiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte schließlich eine Methode optimiert werden, mit der man durch direkte Belichtung von Oligonukleotiden bei 254 nm unter Auschluss von Sauerstoff, ausreichende Mengen an (6-4)-Schaden enthaltener DNA isolieren konnte. Die Kristallstruktur des T(6-4)T-Schadens im Komplex mit der (6-4)-Photolyase aus D. melanogaster konnte mit einer Auflösung von 2.0 Å erhalten werden und zeigte eine für Photolyasen typische Architektur mit einer N-terminalen /-Domäne, einer C-terminalen - helikalen Domäne sowie einem Interdomänen-Loop. Die DNA wird bei der Bindung durch die (6-4)-Photolyase vollständig geöffnet und der Schaden um nahezu 180 ° in die aktive Tasche des Enzyms gedreht. Nach Reduktion mit Natriumdithionit und Belichtung mit Weißlicht konnte die Reparatur auch im Kristall durchgeführt und die entsprechende Struktur (2.7 Å) mit den intakten Basen im aktiven Zentrum erhalten werden (Abbildung 2b). Eine weitere Struktur (2.9 Å) mit dem T(6-4)C-Schaden im Komplex mit der Photolyase zeigte eine ähnliche Struktur verglichen mit dem T(6-4)T-Schaden auf. Anhand der erhaltenen Strukturdaten und weiteren Mutationsstudien konnte nach Aktivitätsbestimmungen der einzelnen Mutanten die katalytisch essentielle Triade His365- His369-Tyr423 charakterisiert werden (siehe Abbildung 2), wobei ebenfalls zwei Co- Kristallstrukturen der Mutanten H365N (3.2 Å) und H369M (3.2 Å) erhalten werden konnten. In keiner der Co-Kristallstrukturen konnten Hinweise auf den angenommenen viergliedrigen Übergangszustand gefunden werden, so dass unter Einbeziehung der Mutationsstudien ein neuer Reparaturmechanismus postuliert wurde. Als zentrales Intermediat wird hierbei ein Radikal am C5 des Pyrimidinrings postuliert, wobei diese These durch Reparaturexperimente mit einem U(6-4)T-Schaden weiter gestützt werden konnte. Durch die Verwendung des modifizierten T(6-4)C*-Schadens und der folgenden Umwandlung in den T(Dew)C*-Schaden, konnte zudem erstmals experimentell nachgewiesen werden, dass die Reparatur der Dewar Valenz-Isomere über die entsprechenden (6-4)- Schäden als Intermediat verläuft. Durch Reparaturexperimente mit der H365N Mutante und der oxidierten Form der (6-4)-Photolyase konnte diese Isomerisierung als ein Elektronentransfer katalysierter Prozess identifiziert werden. Die in diesem Zusammenhang erhaltenen Co-Kristallstrukturen des T(6-4)C*- (2.0 Å) und des T(Dew)C*-Schadens (2.3 Å) zeigten dabei keine großen Änderungen zu dem unmodifizierten T(6-4)C-Schaden auf. Nach den strukturbiologischen und mechanistischen Untersuchungen konnte schließlich noch die Frage des zweiten Cofaktors der (6-4)-Photolyase aus D. melanogaster geklärt werden. Rekonstitutionsversuche mit den vier in Frage kommenden Cofaktoren FAD, FMN, MTHF und F0 haben dabei in UV- und Fluoreszenzmessungen gezeigt, dass nur das F0 von dem Enzym gebunden wurde. Aktivitätsstudien mit dem mit F0 rekonstituierten Enzym haben dabei einen Anstieg der Reparatur um den Faktor 5 ergeben, wobei ebenfalls eine Kristallstruktur mit dem gebunden Cofaktor erhalten werden konnte (2.1 Å). Der Cofaktor konnte zusätzlich durch Extraktion direkt aus Fruchtfliegen in D. melanogaster nachgewiesen werden.