Eva Kranen - Autodisplay komplexer Enzyme für biokatalytische Anwendungen

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Produktbeschreibung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden eine homodimere Prenyltransferase aus Aspergillus fumigatus und eine homotetramere NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis mittels Autodisplay an die Oberfläche von Escherichia coli gebracht. Diese beiden Enzyme können als komplexe Enzyme bezeichnet werden, da sie aus zwei bzw. vier Untereinheiten bestehen und im Fall der NADH-Oxidase (NOx) einen FAD-Cofaktor pro Untereinheit enthalten. Dieser muss in das Enzym inkorporiert werden, damit dieses oxidative Aktivität zeigen kann. Die Oberflächenständigkeit beider Enzyme konnte durch einen Zugänglichkeitstest für extern zugegebene Proteasen belegt werden. Nach Anzucht in LB-Medium zeigte der NOx-Ganzzellbiokatalysator eine Aktivität von 5,54 mU/mL bei Einsatz einer optischen Dichte bei 578 nm (OD578) von 1. Wurde der NOx Ganzzellbiokatalysator in M9-Minimalmedium kultiviert, konnte die Aktivität auf 16,38 mU/mL bei einer OD578 von 1 gesteigert werden. Der NOx-Ganzzellbio¬katalysator war in Zellsuspensionen mit einer OD578 von 10 bei 20 °C und 70 °C ohne Verlust an Aktivität und ohne Verlust der Zellintegrität sieben Wochen lagerfähig. Bei Untersuchung der Wiederverwendbarkeit in fünf wiederholten Reaktionszyklen ließ sich am Ende des fünften Zyklus unter den gewählten Bedingungen noch eine NADH Oxidase-Aktivität von 50 % verglichen mit dem ersten Zyklus detektieren. In einem kombinierten Einsatz mit einer Acetaldehyd-Dehydrogenase konnte der NOx Ganzzellbiokatalysator erfolgreich zur Regeneration des oxidierten Pyridinnukleotid Cofaktors NAD+ eingesetzt werden. Die Prenyltransferase FgaPT2 zeigt ein sehr breites Substratspektrum und akzeptiert neben dem originären Substrat Tryptophan auch 17 weitere Indolderivate. Die Aktivität des FgaPT2 Ganzzellbiokatalysators wurde durch die erfolgreiche Prenylierung der Substrate Indol-3-propionsäure und L-?-Homotryptophan belegt, von denen jeweils 1 mM eingesetzt worden war. Dabei wurden nach 24 stündiger Reaktionsdauer etwa 25 % der eingesetzten Indol-3-propionsäure und 13 % des eingesetzten L ? Homotryptophans durch den FgaPT2 Ganzzellbiokatalysator umgesetzt. LC MS Untersuchungen bestätigten die Identität der entstandenen 4 Dimethylallyl Produkte. Der FgaPT2-Ganzzellbiokatalysator zeigte nach vierwöchiger Lagerung bei 8 °C keinen Aktivitätsverlust. Bei Untersuchung der Wiederverwendbarkeit in drei wiederholten Reaktionszyklen ließ sich auch mit diesem Ganzzellbiokatalysator unter den gewählten Bedingungen eine Umsetzungsrate von 50 % während des letzten Reaktionszyklus verglichen mit dem Anfangswert detektieren.