Frederik Rudolph - Reinigung und Charakterisierung von mTMEM16A und der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors für die 2D-Kristallisation

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Produktbeschreibung

Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors Der P2X7-Rezeptor (P2X7R) gehört zur P2X-Rezeptorfamilie ATP-gesteuerter Kationenkanäle. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen eine gemeinsame Topologie mit zwei Transmembranregionen, einer großen extrazellulären Schleife und intrazellulären N- und C-terminalen Domänen. Drei Untereinheiten einer Isoform assemblieren zu einem funktionellen homotrimeren Rezeptor. Aufgrund seiner Lokalisation in Zellen mit Beteiligung an Schmerzentstehung, Entzündungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen ist der P2X7R ein interessanter Angriffspunkt für die Entwicklungen neuer Arzneimittel gegen verschiedene Krankheiten. Strukturell unterscheidet sich die 595 Aminosäuren umfassende P2X7R-Untereinheit von anderen P2XR-Subtypen (P2X1R-P2X6R) durch eine um 120-200 Aminosäuren längere C-terminale Endodomäne. Funktionelle und biochemische Daten, die von unserer Arbeitsgruppe zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Markwardt in Halle publiziert wurden (Becker et al., 2008), lassen den Schluss zu, dass die C-terminale Endodomäne des P2X7-Rezeptors ein Gating-Modul darstellt, wobei eine trimere Anordnung des Moduls zur trimeren Struktur der P2X7-Rezeptoren passen würde. Modelle, wie solche cytoplasmatische Domänen das Öffnen von Ionenkanälen regulieren, wurden bereits für spannungsabhängige K+-Kanäle durch Kombination funktioneller Daten mit Kristallographie- Strukturdaten abgeleitet. Die C-terminale Endodomäne des hP2X7-Rezeptors (hP2X7 355-595- Protein) wurde in dieser Arbeit in der methylotrophen Hefe P. pastoris überexprimiert und durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Optimierung der Aufreinigungsbedingungen konnte ~1,5 mg hP2X7 355-595-Protein in hoher Reinheit pro Liter Kulturmedium aufgereinigt werden. 2D-Kristallisationsversuche mit dem His-hP2X7 355-595-Protein wurden in Kooperation mit Prof. Schmidt-Krey an der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology in Atlanta im Rahmen eines einjährigen Aufenthalts durchgeführt. Durch die Optimierung der Kristallisationsparameter Lipid-Protein- Verhältnis (LPR), Salz sowie Temperatur wurde die Ausbildung von DMPC- Membranstrukturen günstig beeinflusst und eine Abnahme von zuvor vorhandenen Proteinaggregaten beobachtet. Nach elektronenmikroskopischer Auswertung der Proben zeigte sich, dass es durch DMPC-Zugabe, in einem Lipid-Protein-Verhältnis von 1 bis 5, zu einer Stabilisierung des His-hP2X7 355-595-Proteins kommt. Durch Zugabe von NaCl zum Dialysepuffer konnte die Ausbildung von DMPC-Membranen gefördert werden. Eine Rekonstitution des His-hP2X7 355-595-Proteins in die DMPC-Doppelschicht und eine Ausbildung von kristallinen Bereichen konnte allerdings mit keiner der Parameterveränderungen mit Sicherheit beobachtet werden. Die Optimierung weiterer Kristallisationsparameter ist daher Gegenstand aktueller Untersuchungen. Expression und Reinigung von TMEM16A für 2D-Kristallisationsexperimente Die TMEM16A/Anoctamin-Kanäle konnten 2008 unabhängig von drei Arbeitsgruppen als lang gesuchte Ca2+-aktivierte Chloridkanäle identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppe konnte mittels BN-PAGE-Analyse und Crosslinking-Experimenten erstmals gezeigt werden, dass das in X. laevis-Oozyten und HEK293-Zellen exprimierte TMEM16A-Protein stabil zu Homodimeren oligomerisiert und in homodimerer Form auch in der Plasmamembran dieser Zellen vorliegt (Fallah et al., 2010, Molecular & Cellular Proteomics,). Ziel der fortführenden Arbeit war es, das TMEM16A-Protein in Milligramm-Mengen zu exprimieren und zu reinigen, um es für strukturelle Untersuchungen mittels der 2D-Kristallisation verfügbar zu machen. Eine wichtige Frage war die Identifizierung von Detergenzien, die TMEM16A schonend solubilisieren und gleichzeitig für die Kristallisation geeignet sind. Durch ein umfassendes Screening konnte das nicht-ionische Detergenz C8E4 sowie das Detergenziengemisch CHAPS und Triton X-100 als Detergenzien identifiziert werden, in denen sich TMEM16A als stabiles Homodimer verhält. In anderen untersuchten nicht- ionischer und zwitterionischen Detergenzien lag TMEM16A im nicht-denaturiertem Zustand in unterschiedlichen prozentualen Verhältnissen als Monomer und Dimer vor. Durch Kultivierung in einem Spinner-System im Litermaßstab und affinitätschromatografischer Aufreinigung gelang es, rekombinantes TMEM16A im Milligramm-Mengen in einer Qualität zu isolieren, wie sie für die 2D-Kristallisation benötigt wird. Als weiteres Expressionssystem neben HEK293-Zellen erwiesen sich Sf158-Insektenzellen als geeignet, Milligramm-Mengen an homodimeren TMEM16A-Protein zu produzieren. Im Vergleich zu den in HEK293-Zellen exprimierten TMEM16A wies das Protein in Insektenzellen ein anderes Glykosylierungsmuster auf. Erste 2D-Kristallisationsexperimente mit dem aufgereinigten TMEM16A werden zurzeit im Labor von Prof. Schmidt-Krey am Georgia Institute of Technology durchgeführt.